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科普文章

从原子到生命—结构生物学的前世和今生
发布时间:2017-02-15    6204   墨子沙龙

导语

墨子沙龙的第九期非常荣幸地请到清华大学的颜宁教授为大家做科普报告。颜宁教授在清华大学主要从事重要膜蛋白的结构与功能机理研究,2007年在清华就职,2015年受聘长江学者特聘教授,发表学术论文45篇,自2009年至今以通讯作者在Nature、Science、Cell 发表学术论文16篇,获得美国HHMI首届国际青年科学家奖、国际蛋白质学会青年科学家奖、中国优秀青年科技工作者等多个国内、国际大奖。2015年,颜宁教授与德国德累斯顿工业大学的Stephan Grill教授共同获得了赛克勒国际生物物理奖。

本篇文章根据颜宁教授2016年11月27日在墨子沙龙的报告改编。颜宁教授的报告从物质最基本的结构讲起,引经据典:伦琴发现X射线、布拉格父子提出X-射线晶体衍射公式,沃森、克里克提出DNA双螺旋模型、霍奇金解析维生素分子B12的结构以及肯德鲁、佩鲁兹解析血红蛋白结构等结构生物学发展重要节点,并详细解说了近年兴起的冷冻电镜技术(cyro-EM)的作用原理。技术变革极大地提高了利用冷冻电镜技术解析蛋白结构的分辨率,并使得解析分子量巨大的蛋白复合体成为可能。应用冷冻电镜技术,颜宁解析了多种膜蛋白结构。最后,颜宁又回到了科学的角度,从自身经历鼓舞青少年对科学的探索和热爱之情。


通俗地来说,现代生物学研究就是科学家从人们习以为常的生物现象中找出它们的化学基础。比如睡眠,人们睡着后会做梦,受到外界刺激会惊醒,这是人类对睡眠最基本的认知。而现代生物学家们则会思考,到底是什么物质控制着人类的睡眠,为什么人会觉得困、会做梦?为什么有些梦在醒来后还能记住、复述,有些做梦时很清晰,醒来却怎么也记不得了?为什么一个突然的外力击打会让人醒来,但轻轻的摇晃却让人睡得更香?这些问题都是很重要的生物问题。


作为生物学家,我认为一定是有一些化学物质在起作用,可能是蛋白质,也可能是其他化学小分子的化学反应和相互作用来控制这些过程。


什么是结构


石墨与钻石


石墨与钻石有一个共同点——它们都是由碳元素组成的,但除此之外,它们的物理性质和化学性质完全不同。


石墨与钻石的结构图


从原子分辨率层面而言,石墨是共价键组合、结晶格架为六边形层状结构,层与层之间距离较大,所以石墨很软,你可以用它写字。而钻石的共价键非常强,所以它具有极大的硬度。后来的研究中,我们发现了碳的更多组成方式——石墨烯、足球烯、碳纳米管等等,这些都成为了材料科学里面的前沿研究。而研究它们的组织结构的科学,就是结构化学。这是一个引子,我想告诉大家的是,即使是同样的化学物质,如果具备了不同的结构,就呈现出完全不用的物理性质。


蛋白质是由氨基酸组成的,自然界中虽然只有20种天然氨基酸,但它们通过不同的数量、排列方式等可以组成各种蛋白质。几个氨基酸可以组成小的蛋白质,几千个、上万个氨基酸就可以组成大的蛋白质,即使是由完全相同的几种氨基酸组成的蛋白质,由于排列的位置不同,也会具有不同的序列,不同的性质,由几千、上万氨基酸组成的蛋白质,它的种类就有无数种可能。所以从最基本的角度看,生命是非常复杂的。


20种天然氨基酸结构图


现在的生物学家们在做什么工作呢?就是用不同的方法、渐渐地去理解这个非常神奇的生物世界。


我本人就是结构生物学家,我认为对于这个职业而言,似乎不能用简单的“聪明”或者“笨”来定义。但和遗传学家相比,我觉得我们特别的“懒”。


四五十年代的遗传学家们需要做大量的推理工作,他们是生物界的福尔摩斯。他们看到一点现象,就去思索,背后的原因是什么,他们需要推理,但是很不直观;一些化学家也是这样的,他们根据一条带,就要去幻想出无数种可能;但是对于结构生物学家,我们必须眼见为实。Seeing is believing,我们更愿意去看到,而非推理。当然我这里说到的“看”,并不是指用眼睛去看。我们知道,人类眼睛的分辨率是有限的。什么是分辨率?分辨率就是你能看到的最小尺度。比如我们可以看到一根很细的头发,但我们看不到头发上的鳞片,必须借助于仪器,比如显微镜。


当盐从海水中析出,看上去是白色的一片。如果我们仔细去看,会发现盐是晶体状的,和钻石一样晶莹剔透,并且有有间隔的有序排列。直到有了一种技术——X射线衍射,我们才知道原来在盐晶体里,钠离子和氯离子是相互有序地间隔排列,这就是氯化钠的晶体结构。


放大的食盐晶体和氯化钠晶体结构


什么叫晶体?就是完完全全同样的分子规则反复的空间排列。但是蛋白质、核酸这些巨大分子量的生物大分子的结晶远比氯化钠和氨基酸这种小分子难得多。于是,“结晶”就成了最困难的工作,所以我们总是把这个过程称为“艺术”,而不是“科学”。


人与人打交道主要依靠什么?不是微信,而是用眼睛看这个世界,但是我们知道,人类眼睛的分辨率是有限的。也正是因为人类用晶体的X射线衍射效应“看到”了晶体的结构,才逐渐明白了原子层面的排列。所以说有时候在微观层面“看到”某些东西,可能会促成整个化学学科的革命,更新人类对化学物质的认知。



(二)结构生物学的起源
——X射线晶体学


2014年被确定为国际晶体学年,可以说,结构生物学起源于晶体学理论的发展。1895年,德国物理学家威廉·康拉德·伦琴(Wilhelm Konrad Rontgen)发现X射线,并因此获得历史上第一个诺贝尔物理学奖。


伦琴和首张X射线照片


当时许多物理学家认为X射线是一种特殊的光线,可以产生衍射等波特有的性质。1912年,德国物理学家劳厄(Max von Laue)用实验证实了X射线可以在晶体中产生衍射,才确定X射线是一种波,并因此获得1914年的诺贝尔物理学奖。


1915年,诺贝尔物理学奖授予布拉格(Bragg)父子,年仅25岁的小布拉格是到目前为止最年轻的诺贝尔物理学奖获得者。但是很不幸,当年他是和他父亲同时获奖,所以很多人都认为他是科二代,靠着父亲得奖,但是如果你要真去翻看那段历史——至少我们看到的记录,其实他父亲得奖受益于他的研究。布拉格父子建立了布拉格定律,当我们看到不同的衍射图谱的时候,就可以反过来去推测光栅的大小,以及光栅的空间组成。布拉格定律的发现对于人们认识世界、尤其是微观世界打开了一扇窗。 


布拉格父子


结构生物学三种最主要的研究方法之一——X射线晶体学。这种研究方法是将X射线照射到晶体上,得到一个衍射图谱,再利用计算手段,赋予衍射点的分布三维坐标,不同的强度代表不同的数值,然后再对其进行推算。经过几十年的发展,晶体学的理论已经很成熟了,最难得到的就是蛋白质的晶体,只要拿到蛋白质的晶体,通过解决相位问题的手段,就可以把蛋白质的结构给重构出来,这就是X射线晶体学。


最开始,科学家们利用X射线测量简单的无机物结构,渐渐地,他们开始研究更复杂的物质,比如硅酸盐,最后到了生物分子。利用X射线测量生物分子结构是结构生物学这门科学的开始。结构生物学测量的第一个相对较大的生物分子是维生素B,科学家为了测量它的结构花了很多工夫。英国女科学家多罗西·克劳富特·霍奇金(Dorothy Crowfoot Hodgkin)因测出维生素分子B12的结构,获得1964年的诺贝尔化学奖。


在这之前,历史上还有一个非常重要的生物大分子结构,就是DNA双螺旋。严格来说,DNA双螺旋不是结构,而是模型。1953年,剑桥大学卡文迪许实验室的詹姆斯·沃森(James Watson)和弗朗西斯·克里克(Francis Crick)根据DNA晶体的衍射照片,提出了DNA的双螺旋模型。还有一点大家可能不知道,1953年发表的介绍DNA双螺旋模型的文章非常短,大概只有一页半,1962年获得了诺贝尔医学和生理学奖,按道理这个应该是诺贝尔化学奖。当时化学奖评奖委员会认为他们的工作不够严谨,认为这只是一个模型,一个假想,不够严谨,所以就没有颁发给它。


DNA双螺旋结构


1953年可以说是分子生物学的开端。许多不了解结构生物学背景的人以为提出DNA双螺旋模型的克里克是分子生物学之父,但实际上是佩鲁兹(M.F.Perutz),因为他比其他几位著名的分子生物学家都资深很多,并且一直在从事结晶血红蛋白质X射线衍射的研究。当血红蛋白的结构呈现出来之后,他被公认为分子生物学之父。


1962年,诺贝尔奖组委会将化学奖颁发给佩鲁兹和肯德鲁(J.C.kendrew),以表彰他们在血红蛋白和肌红蛋白结构研究中的贡献。在我们做生物研究的人眼里,1962年的诺贝尔化学奖和生理与医学奖是诺贝尔奖最耀眼的明珠。


显微镜下的蛋白质晶体

 

这里显示的是溶酶体的晶体,溶菌酶可以破坏细菌细胞壁,可能是世界上已知的最容易结晶的蛋白质。在显微镜下面,这个液滴只有两微升,一个晶体大概只有几十微米。我经常和我的女学生开玩笑说如果哪天有男孩子拿着蛋白质的晶体当钻戒向你求婚,你就嫁给他吧,这个人一定是超人,因为这样的钻戒实在太难找了。

之后出现越来越多测量分子结构的方法,包括解析结构的方法,比如电镜和核磁共振,利用这些方法解出的一些重要结构获得了诺贝尔化学奖。很多人都很疑惑,诺贝尔化学奖好像非常青睐整个结构生物学,这是为什么?我现在揭晓答案,第一,因为结构可以很清楚地呈现生物的化学基础;第二,通过这个结构,可以把很多最基本的生命过程非常清晰地向大家展示。


截止到2009年与结构生物学相关的诺贝尔奖



(三)结构生物学的
“不结晶”革命



近些年来,如果大家稍微留意一下,就会知道应用电镜技术进行探测在结构生物学研究中发展的如火如荼,因为它不需要蛋白质结晶。


2013年12月13日,《自然》杂志上刊出了两篇论文,讲的是一个非常重要的离子通道蛋白——TRP离子通道 (TRPV1 channel)。大家都知道吃辣会让舌头发麻,被热水烫到会觉得难受,其实对温度和辣味的感受都是通过TRP离子通道蛋白来调控的,所以这个蛋白非常重要。辣和热在英文里面都是hot。我觉得当时发明这个词的人很聪明,他不懂生物学,但是他懂它的感觉。


很多做X射线晶体学的组都想拿到它的结构,始终没有做成,因为TRP离子通道蛋白非常难结晶。但是到了2013年,突然同时有两篇这方面的论文发表在《自然》杂志上,一下子就震惊了全世界,它的分辨率竟然达到了近原子水平。这在以前对电镜来说是不可想象的。这个英雄是谁呢?他叫程亦凡,是加州大学旧金山分校的教授,我们大家津津乐道的是他竟然做了16年的博士后。他本科是在武汉大学,学的是物理,后来到了中科院物理所学电镜,师从李方华教授,一位非常棒的女科学家。


程亦凡照片


大家都知道,电镜是物理手段,最先开始用电镜研究的都是没有生命的物质,后来才开始研究生物。为什么用电镜探测生物材料这么难呢?因为生物材料太脆弱,而且太难拿。直到60年代,用电镜研究生物材料才开始取得突破,到了70年代末、80年代初,发现可以把温度降得非常低,保证生物样品不被损坏,但由于各种原因,分辨率还是提不上去。最后用电镜研究生物样品,解析了生物材料的结构,扭转了整个局面,让做结晶的科学家有了新的认识。   以前我们普遍认为做电镜的人看不到原子分辨率结构,亦凡他们这个工作一发表真是从此改变了结构生物学的游戏规则。


什么是冷冻电镜成像?我们把生物样品纯化出来,不用结晶。拿出一点点,3微升,放在一个铜网上,除去多余的样品,因为太厚了没有办法透射。然后,用液态乙烷把样品速冻起来,从而不能形成晶体冰,而是无序的冰。得到的一层薄薄的样品,能够让电子通透过去。因为最开始溶液里样品分子的方向是随机的,所以你会看到不一样的投影。因为每一个生物样品其分子量相对比较小,要做的第一步就是把相同方向的生物分子进行分组,即二维分类,这样可以提高它的信噪比。根据生物分子在溶液里面不同的方向,把他们分成各种各样的二维组,并依据一些算法,根据不同的投影重构出它的三维结构,这就是电镜成像。


为什么电镜会有这么一个突破?真正的改变在于它的探测器。就像照相机最开始经历了什么?最开始用的是胶片,成像非常慢。后来就换了CCD(电荷耦合元件),CCD的好处就是成像速度非常快,但是缺点是需要把电子信号转换为数字信号,信噪比越来越差,严重损害了它的分辨率。当时很多科学家就说,如果能够利用感受电子束这种最直接的探测方式,可以将信噪比提高几个数量级。


当时从理论上已经知道,最难的地方在于探测器材料的制备,美国和英国的科学家用了将近20年才终于做出能直接感受电子的探测器。程亦凡教授也对这个硬件做出了一些贡献,当然他的贡献主要是在数据接收上,并不是硬件方面的。


有了这个电子探测器,就可以非常快地接收数据,收集到的不再是一帧一帧的照片,而是“电影”。收集到电影才发现原来在电子成像的过程中,曝光时间长,会导致漂移,因为电子束是非常大的能量,尽管是在冰冻的状态,还是会漂移。第二是在算法上的进步,叫做漂移校正技术(motion correction)。当时程亦凡的博后李雪明(现在已经是清华大学的教授),他在电镜的算法发展上做出了巨大的贡献。就是因为这个电镜软硬件发展,从而使得用电镜解析结构可以轻而易举地达到近原子分辨率。


这就是科学发展,有时可能是理论上早就有了,但是技术上的局限很难实现,由于材料科学、物理科学、化学还有计算科学的进步,又逐渐将处于弱势的生物学手段复活,所以我在等待晶体学重新逆袭的那一天。现在看来近期内电镜探测可能还会笑傲江湖。刚才给大家说的是手段,那我们要这些手段做什么?我们想从更高的分辨率上,更低的尺度上,更快的时间维度上去理解这个生物。


(四)膜蛋白


地球上已知的99%以上的生物赖以生存的能量来自于太阳,那么生物是如何捕获太阳能,并将其转化为化学能量?这是地球上最基本的反应,对于生物圈来说就是光合作用。叶绿体、一些藻类、细菌等都可进行光合作用,它们都具有膜结构。膜上的多种膜蛋白,将光子捕获下来,传递到光反应中心,然后光反应中心的光子再激发电子,从而引发了一系列的化学反应,这就是如何把光子捕获下来变成化学能的过程。通过结构生物学的研究发现,其实光反应系统就是靠蛋白质这个脚手架把叶绿素分子们放到最有利于它们捕获光子、激发电子的位置上。


人类的生命活动能量来源主要是通过呼吸作用。可以说,呼吸作用本质上是一个燃烧过程,将葡萄糖转化成二氧化碳和水。而我们生命中的最重要的一环,就是如何保证它释放出来的能量不会以热量的方式散发掉,而是为生命活动提供能量,而这个过程是循序渐进、环环相扣的。


这个过程是怎么样的呢?糖酵解本质上就是可以把一个葡萄糖变成两个丙酮酸,通过10个酶来催化这个过程,生成了两个ATP和两个NADH。然后关键就是把这个过程中产生的丙酮酸放进线粒体里面,丙酮酸是3碳分子,葡萄糖是6碳分子,线粒体是双层膜的细胞器,进去以后发生了很复杂的循环,这与膜和膜蛋白密切相关,十分复杂。


呼吸作用中很关键的一步是葡萄糖要进入细胞。能让葡萄糖进入细胞的蛋白,就叫葡萄糖转运蛋白(GLUT1),同理,如果是让其他东西进出的,就是他们自己的通道蛋白,或者转运蛋白。通道蛋白打开了,让它长驱直入。转运蛋白就好像是我们在商场的旋转门,我们通过它的旋转进出商场。生物里的很多东西,在现实中似乎都可以找到一些对应的模型。



膜蛋白是最难对付的一大类蛋白,你想做的未必是你能做的。4年前,我痛下决心。作为一枚吃货,就死磕我“想”做的,死磕我们能量来源最重要的葡萄糖如何进入每一个细胞,死磕葡萄糖转运蛋白。葡萄糖是亲水的,无法直接扩散进入细胞,要通过葡萄糖转运蛋白进入到小肠细胞,进入到血液中,运输到各个细胞中,这就需要葡萄糖转运蛋白识别葡萄糖,打开,关上,把它转到细胞里面去。


其实,发现葡萄糖转运蛋白也是经历了一个漫长的过程,几代科学家们历经百年才知道葡萄糖要进入细胞需要某种东西来介导,这个“东西”有什么性质,物理、化学性质,然后才发现是有一个蛋白来介导这个过程,后来又知道了这个蛋白是什么序列,长什么样,怎么工作,这就是一个科学研究的历程。我们所发现的到最后都只是一个中间阶段,起到承上启下的作用。一方面,我们把它的结构呈现出来了,另一方面很多问题也出来了,比如说它的转运速度是由什么决定的,它有没有一些调控,怎么上膜,怎么被降解等等。所以说科学研究,它其实是一个非常漫长,但也是非常有意思的过程。


葡萄糖转运蛋白的工作模型

Deng et al, Nature (2015) 526: 391-6


最后,我想把这句话送给孩子们——Science is cool,science is fun!现在很多科学家都在说这两个词。过一段时间,再回头看你做的这几年科学研究,是非常有意思的,当然在这个过程中免不了有成功、失败,不断地重复,不断地失败,有非常受挫、非常挣扎的过程,可是当你发现你是这个世界上第一个知道这件事,看到这件事,想明白这个事的人的时候,那个过程、那个感觉还是很酷的。