什么？细胞还要身份证？

我们知道，细胞是构成我们人体的基本单位。可是你知道吗？相比于构成细胞的原子、分子，我们恰恰对细胞本身知之甚少。人体里面到底有多少种细胞？它们是如何分布的、如何相互作用的？一直以来，这些问题的答案与人体的很多生命作用息息相关，引发着人们的好奇，但探索起来也困难重重，朦朦胧胧。

为什么对细胞的了解这么有用呢？

我们的身体里面三十万亿个细胞，而这些细胞的种类和分布，它们之间怎么对话、怎么协同完成一些生命过程，我们的了解非常有限。而这些个信息呢，直接关系着人体的奥秘。比方说吧，每个人都会生病，对于很多疾病来说，这个发病的过程就是相应细胞变化的过程，往往在这个过程里，某些细胞的功能、形态、特性都会发生改变。甚至对于像癌症一类的疑难杂症，肿瘤细胞附近很多种细胞都会发生变化，肿瘤细胞和体内正常的细胞（如免疫细胞）还会有很多相互作用。如果我们对这些细胞的种类、分布、分化、相互作用有了深入的了解，我们就可以揭示更多的生命奥秘。

科学家盯上RNA

到底怎么给细胞进行细致的分类和描述呢？科学家想到了RNA。

分子生物学中，有个“中心法则”，说的是遗传物质从载体——DNA传递给RNA， RNA再翻译成蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。对于同一个人来说，不同种类的细胞DNA是相同的，而细胞之所以有各种变化万千的形态和功能，是因为不同细胞里RNA表达和修饰不一样。这些各种各样的RNA是遗传物质DNA转录的产物，人们称其为转录组。而通过对细胞转录组做一个定量分析来测绘细胞种类、甚至描述它们空间分布和相互作用的方法，就叫做转录组的成像。

但是呢，这种美好的想法只是看上去很美，实现起来却困难重重。因为RNA的种类太多了！

在一个细胞里，基因有上万个，而RNA的数目比基因的数目还多若干倍。传统方法怎么做呢？1998年，阿尔伯特爱因斯坦医学院的RobertSinger研究组发明了单分子荧光原位杂交方法（smFISH），这种方法是用荧光标记各种DNA或者RNA，再将这些带了荧光的DNA或者RNA作为探针去探测细胞中的某一特定序列的RNA，以此来检测细胞中某一特定RNA的数量、定义它们的位置。

实际情况中，通过结合不同荧光的探针，这种方法可以同时检测30种不同的RNA分子。但是聪明的你一定看出问题来了——一个细胞中会有好几万种RNA，如果科学家们想同时检测更多的RNA分子，比如上万种不同的RNA该如何呢？难道我们能使用6万种不同颜色的探针去检测嘛？显然绝对做不到。

RNA玩转二进制 编码

颜色的标记办法行不通，科学家开始想其它主意。2005年，庄小威研究组从电子通信领域获得灵感，借助二进制编码的理念，发明了全新的方法去检测细胞中的RNA水平，可以同时检测达六万种RNA，这种方法叫MERFISH（mutiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization）。

我们之前已经说过，单分子荧光原位杂交可以用来看某一种RNA。所以，一个RNA可以用二进位标码来标记——被探针结合的细胞会被点亮（标记为1），其余没有结合的不会亮（标记为0）。这就是第一回合的采集，形成第一个图像；接着，采集第二个image，我们读第二个RNA的二进制标码。每一次的采集会有不同的细胞会被点亮，而每一次反馈的读数都由二进制编码来标记（0或者1）。这样重复下去，这组探针结合到细胞中的各个目标RNA之后会反馈出一组读数。读到N位以后，会得到这样一个图像，把每一轮的标记（0或1）串在一起就成了每一种RNA的条码，每一种RNA都有自己特定的条码。把这些点亮的点全部放到一起，就能得到图一左下的图，其中每一种颜色的点代表一种条码，即一种RNA（图一）。

MERFISH是一个高度多重化的smFISH成像方法。我们来做一个简单的数学题，所以对于一个特定的细胞来说，两次采集数据后所反馈的读数有4种可能性，分别是00，01，10，11，依次类推，当N次采集数据后所反馈的读数是2的N次方。如果N做到16，就可以轻松区分6万种可能性，人体的转录组轻松破解。真的这么乐观吗？

情况远没有这么理想，因为单分子荧光原位杂交这种方法再精确，也是有误码率的。即使这个误码率只有5%，测到第二回合，误码率就将近10%，N达到16的时候，误码率也会大大放大。为此，该实验小组信息时代又借鉴了现代的信息学理念，发展了一种叫容错纠错（error-robust）编码的策略，他们只使用与其他代码至少相差两个或以上比特（二进制单位）的代码，这种方法虽然限制了可检测的不同RNA的多样性（丰度），但却大大提高了准确率。这种想法在转录组成像技术上是前所未有的。

图1 MERFISH方法

MERFISH galle ry

我们一起来透过MERFISH方法来看一看生命细胞吧。

首先，来一个人肺的成纤维细胞系（图二）。科学家用16比特MHD4代码[1]的MERFISH方法同时检测单个细胞中的140种RNA。

A图是每一次用探针杂交样品后的图像以及光漂白（photobleaching）后的图像。阐释这种方法可以有效地去除相邻杂交成像之间的荧光信号，也就是MERFISH方法的必要条件。

B图是经过16回合的杂交成像后（每一种代码表示一种颜色即一种RNA，也就是每一个特意代码的RNA上了伪色，便于分析数据），所得到的所有分子的信息。其中7号红色圈指无法辨认的信号，也就是在16进MHD4代码中没有符合的代码，即便用error correction排除潜在错误信号后仍然存在的错误。所以说MERFISH的方法中所用到的错误排除法并不是100%的，即便排除错误仍然会存在一些无法辨认的信号。

C图是取了B图的一部分，用来展示每一次杂交成像后的潜在的RNA分子。

图2 MERFISH方法同时检测单个细胞中的140种RNA

如果我们用MHD2呢？牺牲了准确度，但是可以同时检测的RNA就多了。图三中是用14进MHD2代码的MERFISH同时在单个细胞中检测1001种RNA。和图二一样，每一种伪色代表的是一种RNA分子，在14回合的杂交成像后所的到的信息，同样，红色圈是模棱两可的信息。

图3 用14进MHD2代码的MERFISH同时在单个细胞中检测1001种RNA

图片来源：

http://science.sciencemag.org/content/348/6233/aaa6090/tab-figures-data[2]

MERFISH除了可以成像单个细胞中的RNA，我们还可以利用它检测染色体（DNA）的空间定位。什么叫染色体的空间定位呢?在真核细胞中，DNA被包装成称作为染色质的复杂大分子结构,而染色质的空间组织严重影响了基因组功能。

近期一些染色体研究发现，单条染色体被分割成长度在数十千碱基(kb)到数兆碱基(Mb)之间的接触结构域或拓扑相关结构域（topologically associating domains，TADs)。

TADs作为非常长的DNA片段，包含着一个或多个基因及其调控元件。TADs是染色质组织的一个保守特征，它的一个重要功能就是形成基因调控的独立区域，同时将它们与邻近区域隔离开来（图四）。如果染色质重排影响TADs的组织形式，那么许多基因的表达都会发生改变，甚至引发多种人类疾病。

图4 TADs示意图

图片来源：Wikipedia

那么研究人员如何利用MERFISH绘制基因组区域的空间位置呢？我们可以想象以下，要想从外太空定位中国的位置，首先需要定位地球，再从地球上找到中国的位置。

科研人员再次利用人肺的成纤维细胞系（IMR90细胞系），尝试用MERFISH方法检测单个成纤维细胞中21号染色体中心100kb区域中的34个TADs的空间定位。

由于人的细胞中有23对染色体（除减数分裂后的细胞以外），所以如果想检测其中21号染色体，我们首先需要定位它的位置。好在通过全基因组测序，我们已经掌握了21号染色体中34个TADs的序列，通过这些信息可以制作专门识别21号染色体上TADs的带荧光的探针，我们可以把这些探针叫做初级探针。

好了，现在我们用初级探针定位到了“地球”的位置，那么下面我们该如何定位“中国”呢？

初级探针实际上除了有与DNA结合的互补区，还有延伸段用来与二级探针结合。二级探针上也偶联了荧光分子，我们可以使用两种不同的荧光，这样只需要17回杂交就可以得到34个TADs的位置。

图五中，A图是这种方法的成像策略；B图是在结合一级探针后的成像，细胞中常染色体是成对的，所以有两个光斑，也就是两个21号染色体；C图是B图的黄色框中的部分，在17轮杂交成像中每一轮成像后的图像；D和E图是21号染色体上34个TADs的二维和三维分布图。

图5 21号染色体及其上面34个TADs的空间分布

虽然目前这种MERFISH方法不是绝对完美，但是它可以通过给单个细胞一个特定的“身份证号”，来帮助我们识别不同种类的细胞。

在人类跟可怕的疾病——比如癌症斗争的过程中，认识和了解不同种类癌细胞的特性是一个巨大的挑战，只有了解了不同种类细胞的发生、生长、扩散、转移以及药理机制，才能有针对性的给病人最好的治疗。

这是一个宏大的课题，庄小威教授曾做过一个比喻：“人体内到底有多少种不同的细胞，这些细胞在空间上是如何分布和相互作用的，对于我们想要掌握人体生命奥秘的人来说，是必须要去了解的图像。如果把人体比作汽车，那么所有的零件一一拆开，你无法知道他们是怎么运转的。只有将他们在空间上组装起来，你才能知道它为什么能飞快奔跑。”

参考文献及说明

[1]MHD全称是modified Hammington distance，MHD4是汉明距离等于四。因为用二进制方法，杂交N次后得到的RNA丰度应该是2N-1，但如果这样的话N次杂交结果中有一次出错就可能代表另一种RNA了，这样错误率很高，所以他们把汉明距离改成4，也就是一窜二进制代码里面至少有4位不一样才算是不同的RNA，这样虽然降低了丰度，但错误率就减少了。

[2]Chen, K.H., et al., RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science, 2015. 348(6233): p. aaa6090.

[3] Wang, S., et al., Spatial organization of chromatin domains and compartments in single chromosomes. Science, 2016. 353(6299): p. 598-602.