作者 | 林梅

《雨人》带来的思考

三十年前，一部讲述手足情深的美国电影《雨人》上映，故事的主角是汤姆克鲁斯饰演的汽车商人查理和他患有自闭症的哥哥雷蒙。面对这个突然出现在生活中的自闭症哥哥，查理从一开始的算计和轻蔑，到最后重拾亲情，感动了无数人，影片斩获了第61届奥斯卡最佳影片等四个奖项。虽然自上映以来已经过去三十年，故事里细腻的情感，依然带给无数观众对于亲情的思考，也让人们直观的了解到了一种特殊的疾病——自闭症。

其实，自闭症是一类广泛性神经系统疾病的总称，包括：瑞特综合症、阿斯伯格综合症、童年瓦解性障碍等病症。通常，患有自闭症的孩子有明显的社交障碍，无法与我们正常沟通，眼睛看得见却对你视而不见，耳朵没问题却对你充耳不闻，自顾自做着重复性的动作，好像活在自己的世界里，所以自闭症又叫做孤独症。自闭症孩子的父母，无法让自己的孩子接受正常的教育融入社会，同时也面临很多来自他人的误解和压力。

上世纪四十年代，美国医生第一次阐述了这种疾病。随着对自闭症研究的深入，人们对它有了一定程度的了解。比如，最初人们认为自闭症是由于父母照顾不周、关心不当导致的性格问题。但随着研究的深入，人们渐渐了解到，自闭症是一种先天性的神经发育障碍，与父母的养育方式并无直接关系。而且,自闭症是一种很复杂的疾病，不仅每位自闭症孩子的表现各有不同，与自闭症有关的基因更是多达上百个，可以说，对自闭症的研究是一个充满了未知的领域，等着我们去探索。

起初，对自闭症的探索非常局限，因为在对意外死亡的自闭症病人的大脑中进行解剖时，并没有发现自闭症病人的大脑中有任何病变，所以人们只能提出一些猜想。

DNA测序技术与自闭症

随着上世纪末期分子生物学的进展，以及DNA测序技术的进步，人们对自闭症的研究渐渐超越早期的临床病理层面，深入到细胞和分子的病理层面，使得人们得以从更微观的视角审视自闭症。经过对大量自闭症病人的遗传筛选，科学家们已经可以基本确认自闭症与遗传因素关系最为密切，人们发现，有一系列重要基因在自闭症病人中发生了突变。

对于神经生物学家来说，他们非常想知道这些基因突变是怎样影响神经系统的发育及功能，进而导致了自闭症。神经生物学家在研究自闭症患者那些突变的基因功能时发现，这些基因有些是与神经发育相关的蛋白编码基因，比如突触蛋白编码基因, 这会不会意味着，自闭症与神经系统的发育特别是突触的正常功能失调有很大关系呢？在孤独症患者体内发生突变的基因突变是否真的导致了神经系统的不正常呢？

说到突触，它是大脑正常工作的必不可少的单元。我们知道，神经元是神经系统最基本的功能单位，但是，神经元彼此之间必须要能够有效传递神经信号, 才能完成最基本的神经功能。神经元间相互连接的界面被称为神经突触, 神经冲动由一个神经元的轴突传导给另一个神经元的细胞体或树突，神经信号才得以传递，所以说，突触是一个非常微小又非常重要的结构。而且，突触是处在动态变化中的，旧的不需要的突触消失, 新的需要的突触又形成, 这个动态过程被某种调控机制精密的操纵着，这套精密的调控背后遵循的代码就是镌刻于体内的基因，科学家们开始着手对这些基因进行研究。

科学家发现，自闭症患者体内一些突变的基因是负责编码在突触中起粘黏功能的蛋白。这些蛋白类似于粘合剂，把突触彼此之间连接起来。其中，有一对叫做neuroligins 和 neurexins 的家族蛋白引起了科学家的注意。美国斯坦福大学 Sudhof 教授研究组早在 20 世纪 90 年代就发现了neuroligins 与neurexins 家族蛋白在突触黏连方面的重要作用。当他发现neuroligins 与neurexins 家族蛋白的编码基因在自闭症患者中发生突变，立刻着手开始研究。其实说起来，这个突变也就是改变一个氨基酸，将451的精氨酸变成了半胱氨酸(R451C)而已。Sudhof团队拿小鼠做起了实验，他们将小鼠基因组 上面的neuroligin3基因也做了对应的突变，然后研究这些小鼠的行为和正常小鼠有什么不同。比如，将小鼠置于一个可以自由运动的三厢，再将被实验鼠置于中间，左厢放着一个玩具，右厢放一个同伴小鼠。正常的小鼠通常更喜欢与同伴小鼠玩耍打闹，但是基因突变的小鼠对同伴小鼠却没有什么兴趣，它并不想去“social”。科学家们还发现，neuroligin3(R451C)蛋白影响了小鼠大脑中的抑制性突触传导,使得神经元网络发生功能紊乱。

其它与突触有关蛋白的编码基因与自闭症的关系也在研究之中。比如，重要的突触后细胞骨架蛋白的编码基因shank3突变、突触黏连蛋白cntnap2,4的基因突变等，都在小鼠实验中显示可以导致神经系统异常和一系列类孤独症及精神疾病的症状。这些证据都表明, 孤独症确实与大脑中突触传导的功能异常有关。 

除了突触蛋白编码基因以外，还有一种基因也在自闭症患者体内显现出异常。这就是甲基化 DNA 结合蛋白 MeCP2(methyl CpG-binding protein 2)的编码基因。

在哺乳动物的DNA中，有一种双核苷酸结构，叫做CpG（CpG是胞嘧啶（C）—磷酸（p）—鸟嘌呤（G）的缩写），这种结构高度聚集的区域，叫做CpG岛。有时，CpG中的C易被甲基化而形成5'-甲基胞嘧啶，甲基化与基因的转录活性有关。所以，在许多基因的启动子（promotor）或“起始”区域周围，甲基化经常被抑制。甲基化的CpG岛之所以能对转录起抑制作用，是通过一些其他一些物质结合实现的，其中有一种叫做MeCP2的蛋白，就是是甲基化结合蛋白家族中的主要成员，它通过与甲基化DNA的特异性结合，抑制其下游靶基因的转录，起到转录调节的作用，因此是重要的转录抑制因子。可以想象，当负责产生MeCP2的编码基因功能异常时，下游靶基因的表达就会异常，疾病就会发生。

MeCP2的编码基因主要在脑内表达，它出了问题，神经元发育、突触的形成都会受影响。1999年，美国贝勒医学院的 Zoghbi 教授研究组发现一种严重的神经发育性疾病瑞特综合征(Rett syndrome)与MECP2 基因突变密切相关, 95%的瑞特综合征病人携带 MECP2 基因的缺失功能突变。瑞特综合征患者因为有部分与孤独症患者类似的表型, 早期也被归为孤独症谱系障碍的一种 (autism spectrum disorders, ASD)。反过来，当MECP2由于复制异常而导致拷贝数增多时, 也会导致最近鉴定出的MeCP2重复综合症(MECP2 duplication syndrome)的自闭症。所以, 体内这个MECP2基因的表达必须适度, 过多或者过少, 都会引起神经突触及神经系统功能的异常, 从而导致自闭症。

中国研究团队的进展

但是，要想攻克自闭症，仅仅知道这些大道理远远不够。要想这些基因到底是怎么影响动物的神经发育和行为表型的，还是要建立可靠的动物模型。小墨为大家介绍过基因编辑技术（《上帝的手术刀——基因编辑将如何改变人类？| 王立铭》），正是利用基因编辑工具，科学家把小鼠体内与人类自闭症对应的同源基因进行敲除与突变，这些基因突变的小鼠的确展现出与瑞特综合征非常相似的表型。同时, MECP2基因过量表达的小鼠模型模型也展现出明显的社交功能障碍。

但是，人的神经系统是相当复杂的，对于人类的高级神经活动，仅仅用小鼠这种啮齿类动物来模拟，实在是太局限了，毕竟人类大脑的复杂程度不是老鼠可以比拟的，我们需要一个亲缘关系相近的物种来构建模型研究自闭症。什么动物与我们人类最接近呢？当然是非人灵长类。非人灵长类有着和我们人类类似的一些复杂社会行为，和相似的生物学特征。在进化史上，人与老鼠一亿年前就分道扬镳，但是人与猴在2000万年前才分离，人和其他灵长类动物在基因序列和脑结构上都有着很高的相似度。利用非人灵长类建立脑疾病动物模型，研究神经疾病是最合适不过的了。从2014年开始，国内的科研小组在这方面的工作陆陆续续被报道。

中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所的仇子龙研究组和孙强研究员的团队与苏州灵长类平台合作，拿食蟹猴做起了实验。食蟹猴是一种比猕猴小一些的灵长类，有长长的尾巴，因为喜食螃蟹及贝类而得名。研究人员利用 TALEN（慢病毒侵染法，一种基因编辑工具），将外源的MECP2基因插入了食蟹猴的基因组中, 建立了在神经系统中特异性过表达MECP2基因的转基因食蟹猴模型。接着，他们开始研究这些转基因食蟹猴的生长发育、社交行为和学习能力。

科研人员发现，相对于正常的野生型食蟹猴，MECP2 转基因食蟹猴体重发育迟缓、脂肪酸代谢异常，这两种表型与MECP2倍增综合症患者的临床表现是一致的。接着，科学家开始观察转基因食蟹猴的行为。首先，科学家统计了转基因食蟹猴的行动路线，发现转基因食蟹猴会明显花费更多的时间在重复的行动路线上；接着，实验人员人为地给予转基因食蟹猴威胁性刺激时，相对于正常野生猴，它们表现出明显的焦虑与警惕；我们知道，社交行为及能力的检测对于自闭症表型具有最为重要的意义，在最重要的社交相关的行为学实验中，无论是社群内社交时间还是不同社群配对的社交时间，转基因猴均显著低于对照组；而在与学习记忆相关的威斯康星测试中，转基因组虽然没有显示出学习能力的异常，但表现出重复性的刻板行为。这些结果与 MECP2 倍增综合征患者的临床表型非常相似。

既然自闭症与基因密切相关，那这种自闭症会不会遗传给下一代的？为了得到答案，科学家扮演了一把“送子观音”，它们将转基因食蟹猴的精巢组织移植至裸鼠皮下并使用激素促进成熟，在得到转基因食蟹猴的成熟精子后，通过体外受精以及人工受孕技术，成功地在短期内得到了原代转基因食蟹猴（F0）的子代猴（F1)。深度测序结果显示，食蟹猴爸爸体内的外源的 MECP2 基因插入位点通过种系传递作用遗传到了食蟹猴宝宝的基因组中，并显示出孟德尔式遗传分离的现象。通过Western Blot 检测，这些转基因食蟹猴宝宝的大脑中也能够特异性地表达外源的MeCP2基因，也就是说，猴宝宝从爸爸身上遗传到了神经系统中特异性过表达MeCP2的特性。

接着，科学家也研究了这些猴宝宝——也就是子代转基因食蟹猴在不同社群中的配对社交行。结果也显示，野生型与野生型配对组中的社交时间要显著高于转基因型与转基因型配对组的社交时间，这种社交频率的显著下降，与转基因猴爸爸、还有自闭症患者都是十分相似的。这些都清楚地证明了，自闭症确实是一种遗传性疾病。

自闭症是一种十分复杂的疾病，这些工作都只是人类刚刚看到了它的冰山一角，还有大片区域隐藏在未知的深海里。食蟹猴这种人类的朋友不仅会帮助我们在基础研究上进一步揭开自闭症的发病机制，未来还会在临床上为我们的治疗和测试提供模型。等到人类最终攻克自闭症的那天，除了要感谢科学家和医生，还请不要忘记了这些可爱的小生灵。

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P4来自仇子龙课题组